Biologie Question #2958
Ram Ajore (Genre: mâle, Àge: 25 années) de Delhi, INDE sur 29 septembre 2005 demande:
Ce qui sont les manières dans la biologie moléculaire de montrer la confirmation de l'hybridation sur une surface pleine pour l'ADN autre que des méthodes radiolabelling et par électron microscopie-basées. S'il y en a en ce qui concerne l'électrophorèse ? Je suis intéressé par la manière la plus simple qui pourrait être faite avec les équipements disponibles minimum ?
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La réponse
La méthode non radioactive la plus simple pour visualiser l'hybridation est une méthode non radioactive de sonde. Si vous avez jamais fait une tache méridionale ou pointillez la tache, vous aurez accompli environ 1/3 de ceci. Si vous avez fait une tache occidentale, encore 1/3.
La première différence est dans la façon dont vous préparez la sonde. La sonde est faite ou marquée avec des drapeaux au lieu de 32P. Il y a trois manières principales de faire cela : 1) achat une sonde pendante ; 2) PCR amplifient l'ordre de sonde avec le drapeau-dUTP au lieu du dTTP et 3) l'utilisation Klenow « coulent » sonde marquée en utilisant le drapeau-dUTP au lieu du dTTP. Les deux derniers sont disponibles comme kits pour marquer de plusieurs fabricants. Trois drapeaux sont digoxigenin, fluroscein ou biotine.
Peut-être vous avez deviné le système de détection. Une fois que vous avez accompli votre hybridation, vous procédez sonder la détection en utilisant l'anticorps ou la streptavidin-enzyme conjugue comme la peroxydase de raifort sauvage ou la phosphatase alkaline. Le système entier de détection employant ces conjugés est infiniment comme faire une tache occidentale. Encore les kits sont disponibles. Les conjugés sont alors anti-creusent-HRP, anti-fluroscein-AP, ou SA-HRP comme exemples.
En bref, le protocole procède comme ceci :
Marquer la sonde : (J'ai employé PCR et Klenow). Établi la réaction, une fois qu'elle est complète, vous devriez vérifier l'incorporation de drapeau tout comme toi faites l'incorporation 32P en faisant une tache de point de sonde titrée. Procéder à partir de ceci à la détection discutée ci-dessous.
Une fois que vous avez la sonde marquée suffisante, faire votre électrophorèse et puis transférer l'ADN à la membrane en nylon en utilisant la méthode de méridional. Les serviettes de papier sont technologie assez minimale et nous l'employons toujours dans notre laboratoire.
Une fois que l'ADN a transféré (nuit d'excédent), laisser la membrane sèche et procéder à l'hybridation ou entreposé dans l'obscurité.
Hybriziation : Ajouter la solution sufficent d'hybridation (sans sonde) à la membrane au pre-hyb pendant environ une heure, puis ajouter la quantité de sonde requise basée sur l'incorporation de la biotine. Hybrider avec se mélanger à la bonne température pour votre sonde durant la nuit. Le jour suivant, laver la tache avec le nombre requis de lavages.
Détection : Mettre la tache dans protéine-bloquent la solution (lait écrémé par exemple). Bloc avec basculer pour la demi-heure ou ainsi à la droite. Ajouter la quantité requise de conjugé d'enzymes pour la superficie de la tache et du volume du bloc que vous avez (par exemple : 1/3000 dilué en 10 ml). Roche pour 1 heure ou ainsi. Lavage avec salin protégé. Détecter avec le substrat de membrane d'enzymes. Le substrat de détection peut être chromogène comme le mTMB augmenté ou même luminescent/film pour une plus grande sensibilité.
Ces protocoles prendront environ 3 jours pour accomplir et seront plus sensibles plus rapide et probable que 32P juste parce que vous ne devez pas attendre des jours l'exposition du film. En utilisant le substrat chromogène nous avons eu de bons résultats dans un délai de 10 minutes ou ainsi. Avec les substrats luminescents, aussi peu que quelques secondes peuvent être suffisantes pour obtenir le signal sur le film radiographique. Le système d'enzyme/substrate dépend alors de votre accès aux cabinets noirs et à l'équipement de se développer.
Si vous google « méridional non radioactif », vous trouvez des liens aux protocoles et aux fabricants.
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